2015临床助理医师考试生物化学第十三单元

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　　第十三单元 重组DNA技术

　　第一节 重组DNA技术概述

　　一、重组DNA技术相关的概念

　　(一)克隆与克隆化 所谓克隆就是指来自同一母本的所有副本或拷贝的集合;获取同一拷贝的过程称为克隆化，又称无性繁殖。克隆可以是细胞的，也可以是分子的。分子克隆专指DNA克隆。

　　(二)基因工程 亦称遗传工程，就是应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质――同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA与载体DNA结合成一复制子，继而通过转化或转染等导入宿主细胞(安全宿主菌)，生长、筛选出含有目的基因的转化子细胞。转化子细胞经扩增、提取获得大量目的DNA的无性繁殖系，即DNA克隆，又称基因克隆。“克隆”过程中，将外源DNA(感兴趣的DNA)插入载体分子所形成的复制子是杂合分子――嵌合DNA，所以DNA克隆、或基因克隆又称重组DNA。涉及上述操作过程的各项技术统称重组DNA技术或基因工程。

　　(三)工具酶 在基因工程技术中需要一些基本工具酶进行操作。例如，对基因或DNA进行处理时需利用序列特异的限制性核酸内切酶在准确的位置切割DNA，使较大的基因片段或DNA分子成为较小的DNA片段;有时需在DNA连接酶催化下使较小的DNA片段连接成较大的DNA分子。此外，DNA聚合酶、反转录酶、多聚核苷酸激酶和末端转移酶等也是基因工程技术中常用的工具酶。

　　限制性核酸内切酶就是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制性核酸内切酶有三类，基因工程技术中常用的限制性内切酶为II类酶，例如Eco R I、Bam H I等就属于这类酶。大部分II类酶识别DNA位点的核苷酸序列呈回文结构。有的限制性内切酶切割双链DNA后产生5’突出的粘末端，有的限制性内切割 DNA后产生3’突出的粘末端或平端。无论何种内切酶、切割后产生何种末端，切割的DNA总是具有5’磷酸基和3’羟基基团。

　　【执业】1.限制性内切酶是一种

　　A.核酸特异的内切酶

　　B. DNA特异的内切酶

　　C.DNA序列特异的内切酶

　　D.RNA特异的内切酶

　　E.RNA序列特异的内切酶

　　答案：C

　　【执业】2.限制性内切酶的作用是

　　A.特异切开单链DNA

　　B.特异切开双链DNA

　　C.连接断开的单链DNA

　　D.切开变性的DNA

　　E.切开错配的DNA

　　答案：B

　　(四)基因载体 又称克隆载体。这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。充当克隆载体的DNA分子有质粒、噬菌体和病毒DNA，它们经适当改造后成为具有自我复制、表达功能的克隆载体。

　　质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，分子量小的为2～3kb(千碱基)，大的可达数百kb。质粒分子本身含有复制功能的遗传结构，能在宿主细胞独立自主地进行复制，并在细胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。质粒携带有某些遗传信息，如对某些抗生素的抗性等，所以质粒在细菌内存在会赋予宿主细胞一些遗传性状。质粒DNA的自我复制功能及特殊遗传信息在基因工程操作如扩增、筛选过程都是极其有用的。

　　【执业】4.细菌“核质以外的遗传物质”是指(2002)

　　A.mRNA

　　B.核蛋白体

　　C.质粒

　　D.异染颗粒

　　E.性菌毛

　　答案：C

　　(五)聚合酶链反应 在有模板DNA、特别设计合成的DNA引物及合成DNA所需要的三磷酸脱氧核苷存在时，向DNA合成体系加入热稳定的Taq DNA聚合酶，反应体系经反复变性、退火及扩增循环自动地、往复多次地在两引物间进行特定DNA片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，这就是聚合酶链反应(PCR)。PCR基本工作原理概括如下：反应体系中的一对引物分别与模板DNA两条链的3’端特定序列互补，并恰好使所选择的互补序列分别位于待合成 DNA片段的两侧。将反应体系置于特殊装置(自动温度循环器，俗称PCR仪)中，加热至高温(一般为94℃、90s)使模板DNA变性，再退火(55℃、 2min)，使引物与模板互补成双链，再升温至72℃，Taq DNA聚合酶催化DNA的聚合反应(通常为3min或视情况而定)。以后再变性、退火，聚合，如此循环改变温度，使聚合反应重复进行。由于每次温度循环所产生的DNA均可作为下次循环合成DNA时的模板，故可使目的DNA片段在两引物间按指数扩增，经历25～30次温度循环后DNA可扩增至一百万倍以上。

　　【执业】5.现在医学科学工作者通过获得大量特异DNA片段，结合适当的分析技术即可鉴定基因缺陷。当前临床或研究室获得大量特异DNA片段最流行的方法是

　　A.化学合成

　　B.DNA合成仪合成

　　C.从外周血细胞大量制备

　　D.基因克隆

　　E.聚合酶链反应

　　答案：E

　　(六)基因文库和cDNA文库 见目的基因的获取。

　　【执业】3.关于重组DNA技术的叙述，错误的是(2002)

　　A.质粒、噬菌体可作为载体

　　B.限制性内切酶是主要工具酶之一

　　C.重组DNA由载体DNA和目标DNA组成

　　D.重组DNA分子经转化或传染可进入宿主细胞

　　E.进入细胞内的重组DNA均可表达目标蛋白

　　答案：E

　　二、基因工程基本原理

　　一个完整的基因工程基本过程包括：目的基因的获取，基因载体选择与构建，目的基因与载体的拼接，重组DNA分子导入受体细胞，筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞(转化子)及目的基因的表达。

　　(一) 目的基因的获取 所谓目的基因就是欲分离的感兴趣的基因，或欲表达的有意义的编码基因。获取目的基因有如下几种途径：①化学合成法：如果已知某种基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出该多肽编码基因的核苷酸序列，再利用DNA合成仪通过化学法合成目的基因;②基因组DNA：分离组织或细胞染色体DNA，利用限制性核酸内切酶将染色体DNA切割成基因水平的许多片段，其中即含有我们感兴趣的基因片段。将它们与适当克隆载体拼接成重组DNA分子，继而转入受体菌扩增，使每个细胞内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。不同细菌所包含的重组DNA分子内可能存在有不同的染色体DNA片段，这样生长的全部细菌所携带的各种染色体DNA片段就代表了整个基因组，这就是所谓的基因文库。基因文库涵盖了基因组全部基因信息，也包括我们感兴趣的基因。建立基因文库后，结合适当筛选方法从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，再行扩增，将重组DNA分离、回收，以获得目的基因的克隆; ③cDNA:以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA(cDNA)，再复制成双链cDNA片段。cDNA片段与适当载体连接后转入受体菌，扩增为cDNA文库。与基因文库类似，由总mRNA制作的cDNA文库包含了细胞全部mRNA信息，自然也含有我们感兴趣所编码cDNA。从cDNA 文库筛选出特异的cDNA克隆就是分离某种蛋白质编码序列。

　　(二)克隆载体的选择和改建 外源DNA片段离开染色体是不能复制的。如果将外源DNA连到复制子上，外源DNA则可作为复制子的一部分在受体细胞中复制。这种复制子就是克隆载休。基因工程技术中克隆载体的选择和改建是一项极富技术的专门工作。

　　(三)基因与载体的连接 将目的基因与载体DNA通过连接酶共价连接在一起，即DNA的体外重组。

　　(四)重组DNA导人受体菌 受体菌多为大肠杆菌K―12衍生的安全宿主菌。这种安全宿主菌经特殊方法处理，使之成感受态细胞，即具备接受外源DNA的能力。根据重组DNA时所采用的载体性状不同，导入重组DNA分子有转化、转染和感染等不同手段。

　　(五)重组体的筛选 重组体DNA分子导入受体细胞后，经适当的培养板培养得到大量转化子菌落或转染噬菌斑。因为每一重组体只携带某一外源基因，而转化或转染时每一受体细胞 (菌)又只能接受一个重组体分子，所以应设法鉴定哪一菌落或噬菌斑所含重组DNA分子确实带有目的基因，这一过程即为筛选或选择。筛选有直接筛选法(如抗药标志选择、标志补救、分子杂交法等)和免疫学方法(如免疫化学法及酶免检测分析等)。

　　(六)克隆基因的表达 又称蛋白质表达。大肠杆菌是最常用的原核表达体系，酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞是多用的真核表达体系。由于缺乏转录后加工机制，大肠杆菌只能表达克隆的 cDNA，而不宜表达真核基因组DNA;由于缺乏适当的翻译后加工机制，大肠杆菌表达真核蛋白质不能形成适当的折叠或糖基化修饰;表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具有活性尚需经复性等处理。相反，真核表达体系、尤其是哺乳类动物细胞(如COS细胞和CHO细胞)是当前较理想的蛋白质表达体系。克隆化的转基因动物也可用于蛋白质表达。

　　第二节 基因工程与医学

　　基因工程作为分子生物学发展的一个重要领域，不但为生命科学的理论研究提供了崭新的技术手段，而且为工农业生产和医学领域的发展开辟了广阔的前景。分子医学正是基因工程技术及其他分子遗传学技术、理论与医学实践相结合的结果。分子医学包括以下内容。

　　一、疾病基因的发现

　　根据克隆基因的定位、性质和功能研究所提供的线索，可进―步确定克隆的基因在分子遗传病中的作用。因此，某个疾病相关基因的发现不仅可寻致新的遗传病的发现，而且对遗传病的诊断和治疗都是极有价值的。

　　二、发展新药物

　　利用基因工程技术生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界上的一项重大产业。目前已经或正投入市场的基因工程产品有胰岛素、生长素、促红细胞生成素、因子VIII、白介素-2、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、肥大细胞生长因子及白血病抑制因子等。

　　三、DNA诊断

　　DNA诊断又称基因诊断，目前已发展成为一门独具特色的诊断学科――DNA诊断学。DNA诊断是利用分子生物学及分子遗传学的技术和原理，在 DNA水平上分析、鉴定遗传性疾病所涉及的基因的置换、缺失或插入等突变。目前用于DNA诊断的方法很多，但其基本过程相似：首先分离、扩增待测的DNA 片段，然后利用适当的分析手段，区分或鉴定DNA的异常。目前广泛用于待测基因的分离及扩增技术是PCR技术，其次是连接酶链反应。常用的DNA分析手段有限制性片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、核酸分子杂交、变性梯度胶电泳、核酸酶A技术以及DNA序列分析等。

　　四、基因治疗

　　所谓基因治疗就是向功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。针对体细胞进行基因改良的基因治疗称体细胞基因治疗，这类基因治疗仅单独治疗受累组织，类似于器官移植。性细胞基因治疗因对后代遗传性状有影响，目前仅限于动物实验(转基因动物)，以测试各种重组DNA在矫正遗传病方面是否有效。

　　五、遗传病的防治

　　受累疾病基因克隆不仅为医学家提供了重要工具，使他们能深入地认识、理解一种遗传病的发生机制，为寻求可能的治疗途径、预测疗效提供了有力手段;更重要的是可以利用这成果进行极有意义的产前诊断，而后通过治疗技巧与治疗、预防能力的结合，从根本上杜绝遗传性疾病的发生和流行。

　　(一)产前诊断 产前诊断可以通过胎儿组织活检、羊膜腔穿刺、羊膜绒毛样品及母体血循环中的胎儿细胞进行。从安全角度考虑，后者最值得提倡。从方法学角度考虑，可以进行染色体组型分析，发现染色体异常;更可以利用DNA诊断学方法分析特异基因缺陷。(见DNA诊断)。

　　(二)携带者测试 基因测试常用于检出隐性遗传病携带者，包括隐性遗传病受累个体家庭的其他成员和有特殊遗传病死亡家庭的危险人群。如果能建立可行的携带者测试方法，并能检出其绝大多数携带者，对指导婚姻和生育是很有价值的。

　　(三)症候的诊断 由于对某些成人发病有关基因已有所掌握，故而在综合征发生前可能做出预测，协助他们做生活方式的调节、工作调整及生育的选择等。

　　(四)遗传病易感性 很多遗传病并非限于单基因缺陷，而是由多基因受累或是遗传和环境因素综合引起的。在这种情况下，一个或多个基因缺陷的存在会使个体对发病诱因极度敏感而易于发病。比如，有LDL(低密度脂蛋白)受体基因缺陷的个体同时有高胆固醇血症，其冠状动脉发病率要比单纯高胆固醇血症者为高。一个发病个体的结局也依赖于其它基因缺陷和环境因素、生活习惯的影响。因此，根据DNA诊断，做好疾病的早期预测并注意环境卫生和个人生话方式，可以达到预防的目的。

　　【总结】本章考点包括DNA重组的酶，最常用的是限制性内切酶特点，DNA重组的基本环节及克隆载体的选择等。限制性内切酶识别DNA的特异序列，并在识别点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，重组DNA中常用的为Ⅱ类酶。

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